CARACTERIZAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO E METILAÇÃO DO GENE P21CDKN1A/CIP1 EM TUMORES MAMÁRIOS CANINOS
Defesa de Mestrado: 20 de abril de 2018
Local: SALA SAT - 02, Instituto de Ciências Biológicas/UFPA.
Horário: 14:30h
Título: CARACTERIZAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO E METILAÇÃO DO GENE P21CDKN1A/CIP1 EM TUMORES MAMÁRIOS CANINOS
Autora: Raissa Melo de Sousa
Orientadora: Profa. Dra. Bárbara do Nascimento Borges
Resumo: A maioria dos tumores mamários caninos são malignos, fazendo com que o animal venha a óbito. Um dos fatores envolvidos nessa patogênese é a alteração no nível de expressão do gene P21, este por sua vez codifica uma proteína que pode inibir a iniciação e a progressão tumoral. Um evento que pode afetar o nível celular da proteína p21 e o perfil de metilação desse gene, podendo ocasionar um silenciamento gênico ou uma superexpressão dele. Considerando a importância funcional desse gene, este estudo tem o objetivo de avaliar o perfil de metilação e expressão do gene P21 em tumores mamários de cadelas do estado do Pará, com o intuito de identificar marcadores moleculares de diagnóstico precoce, sobrevida e prognóstico. Para isso, 83 amostras de tecidos tumoral e não tumoral foram coletadas no Hospital Universitário Mário Dias Teixeira, em Belém. O DNA e RNA de cada amostra foram extraídos utilizando kits específicos. Para as análises de metilação, o DNA obtido foi submetido ao processo de modificação, com posterior técnica de Bisulfite Sequencing PCR, utilizando iniciadores específicos para região e posterior visualização em gel de agarose 2%. Os resultados do sequenciamento foram analisados no software BiQ Analyzer a fim de avaliar o padrão de metilação. Para análise de expressão gênica, foi realizada a quantificação do mRNA do gene-alvo utilizando a técnica de PCR em tempo real, utilizando como controles constitutivos os genes GAPDH e HPRT1. Com análise estatística feita por meio dos testes Exato de Fisher, Odds Ratio e Mann-Whitney no programa GraphPad Prism, considerando os resultados significativos quando p ≤0.05, com intervalo de confiança 95%. Para avaliação do perfil de metilação, foi realizada a caracterização das ilhas CpGs do gene P21, sendo que a ilha 1 está localizada em um íntron com 34 sítios CGs, enquanto que a ilha 2 foi identificada no éxon, com 22 sítios CGs. Ambas amplificadas gerando um fragmento de ~300pb. NA ilha 1 não foi detectada metilação, enquanto que a ilha 2 estava metilada, contudo o perfil de metilação das ilhas não foram diferentes entre as amostras tumorais, não tumorais e controles, não sendo possível comparar os valores de metilação com os dados clínicos e de expressão, sugerindo que essas regiões não estão alteradas. Os níveis de expressão das amostras tumorais foram baixos quando comparados com as amostras não tumorais e controle, com p (0.0001), demostrando que o papel de p21 nesses tumores pode se apresentar alterado, porém não sendo estatisticamente significativos quando correlacionados com os dados clínicos histopatológicos dos pacientes. No entanto foi observada uma expressão reduzida na sobrevida de animais >1 ano de idade, e uma expressão elevada em animais com sobrevida < 1 ano de idade, sugerindo a influência de p21 como um marcador de prognóstico. Ainda são necessários estudos mais detalhados do gene P21 para verificar se essas alterações poderão ser utilizadas como marcadores moleculares, e assim colaborar no prognóstico e detecção do câncer na espécie.